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疫苗被認(rèn)為是終止此次新冠大流行，并幫助恢復(fù)全球經(jīng)濟(jì)的最有效方法之一。來(lái)自上海交大、復(fù)旦大學(xué)等機(jī)構(gòu)的聯(lián)合科研團(tuán)隊(duì)最近設(shè)計(jì)了一款mRNA新冠疫苗。該疫苗通過(guò)模擬冠狀病毒表面蛋白和內(nèi)部核酸，從而結(jié)合了滅活疫苗和mRNA疫苗的功能，這為全球的抗疫提供了一個(gè)全新的疫苗平臺(tái)。這款疫苗名為ShaCoVacc，通過(guò)單次注射，即可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的刺突特異性體液免疫反應(yīng)，并具有有效的中和活性。

值得注意的是，目前mRNA新冠疫苗還未有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)數(shù)據(jù)披露，該團(tuán)隊(duì)提供的數(shù)據(jù)也是全球首個(gè)。以上研究來(lái)自當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月15日，《單劑量SARS-CoV-2模擬顆粒疫苗誘導(dǎo)有效的中和活性》（A single dose SARS-CoV-2 simulating particle vaccine induces potent neutralizing activities），研究人員來(lái)自上海交通大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、上海本導(dǎo)基因技術(shù)有限公司、國(guó)家北京藥物安全評(píng)價(jià)研究中心、貴州醫(yī)科大學(xué)。該項(xiàng)研究的通訊作者為復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院應(yīng)天雷研究員、復(fù)旦大學(xué)附屬上海眼耳鼻喉科醫(yī)院副主任醫(yī)師洪佳旭，以及上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院蔡宇伽研究員。

為了產(chǎn)生類(lèi)似天然的免疫原，又不引起感染，研究者通過(guò)將編碼mRNA刺突蛋白（Spike）注入的病毒模擬顆粒（VSPs）內(nèi)部，該病毒模擬顆粒由慢病毒顆粒衍生而來(lái)；研究者還對(duì)病毒模擬顆粒表面的刺突蛋白進(jìn)行了修飾。該研究表征了新疫苗平臺(tái)的mRNA拷貝數(shù)、糖基化狀態(tài)、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和先天免疫特性。

重要的是，研究顯示ShaCoVacc通過(guò)單次注射，即可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的刺突特異性體液免疫反應(yīng)，并具有有效的中和活性。另外，研究者使用肽微陣列公開(kāi)了刺突特異性抗體的表位，并揭示了對(duì)特異性中和抗體敏感的表位。這些結(jié)果支持ShaCoVacc作為COVID-19的候選疫苗，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，而病毒模擬顆粒可以作為新興傳染病的新疫苗平臺(tái)。

在過(guò)去的幾十年中，許多疫苗平臺(tái)已經(jīng)被批準(zhǔn)用于市場(chǎng)或臨床試驗(yàn)。減毒活疫苗是弱化的病原體，可引起強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但也有感染風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)免疫功能低下的人。滅活疫苗可殺死具有完整結(jié)構(gòu)的病原體并破壞其遺傳物質(zhì)，因此風(fēng)險(xiǎn)較低，但功效也較低。

蛋白質(zhì)亞單位疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗通常是安全的，但很難從本質(zhì)上反映出病毒免疫原的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。病毒樣顆粒（VLP）是殘缺顆粒，具有能夠以其天然構(gòu)象呈現(xiàn)病毒刺突并引發(fā)構(gòu)象依賴(lài)性中和抗體的能力。而更類(lèi)似于病原體的VLP其表面有刺突結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有編碼抗原核酸。哪種疫苗平臺(tái)真正適用于SARS-CoV-2仍未知，這使得開(kāi)發(fā)新的疫苗平臺(tái)具有重要意義。由于在新冠患者康復(fù)期中已檢測(cè)到中和抗體，因此模擬SARS-CoV-2的疫苗可以將抗原傳遞給免疫系統(tǒng)，這與真實(shí)病毒的方式幾乎相同，從而激發(fā)類(lèi)似的有效免疫響應(yīng)。

研究者設(shè)計(jì)了一種候選疫苗，方法是將刺突蛋白包封在病毒模擬顆粒（VSP）中，并對(duì)其表面進(jìn)行修飾。該病毒模擬顆粒以慢病毒顆粒的形式分別以mRNA和蛋白質(zhì)模擬野生型SARS-CoV-2。假設(shè)，通過(guò)攜帶mRNA的慢病毒顆粒產(chǎn)生過(guò)程中，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全長(zhǎng)刺突的表達(dá)。

為了將全長(zhǎng)刺突mRNA包裝到病毒模擬顆粒中，研究者還設(shè)計(jì)了一個(gè)刺突構(gòu)建體，該刺突構(gòu)建體在其轉(zhuǎn)錄物上表達(dá)帶有6X MS2 stem loop的刺突蛋白，這使得刺突mRNA通過(guò)與MS2外套融合的GagPol相互作用而被包裝到病毒模擬顆粒中。

同時(shí)，作為包膜蛋白，刺突蛋白會(huì)自動(dòng)組裝到病毒模擬顆粒的膜中。

為了檢查是否已將刺突蛋白mRNA按照設(shè)計(jì)包裝到慢病毒顆粒中，研究者進(jìn)行了RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)每個(gè)病毒模擬顆粒平均有3或4個(gè)拷貝的刺突蛋白mRNA。為了驗(yàn)證刺突蛋白是否已經(jīng)組裝成病毒模擬顆粒及其糖基化狀態(tài)，研究者以整合缺陷型慢病毒（IDLV）為對(duì)照對(duì)病毒模擬顆粒的裂解物進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。分析發(fā)現(xiàn)，其成功修飾了帶有或不帶有病毒模擬顆粒突變的刺突蛋白，同時(shí)可以裝載更多的突變此刺突蛋白。

由于糖基化影響疫苗的免疫原性和免疫優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)檢查了病毒模擬顆粒表面刺突的糖基化狀態(tài)。值得注意的是，PNGase F處理后，S2帶向下移動(dòng)，表明病毒模擬顆粒上的刺突蛋白被N-連接的糖基化修飾，這與質(zhì)譜法揭示的SARS-CoV-2的近期發(fā)現(xiàn)一致。

接下來(lái)，研究者將病毒模擬顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至293T細(xì)胞并評(píng)估了刺突蛋白的表達(dá)。在感染后36小時(shí)收獲了細(xì)胞，進(jìn)行Western印跡分析。在這里，研究者仍然觀(guān)察到病毒模擬顆粒在293T細(xì)胞中的刺突蛋白表達(dá)，表明VSV-G被共組裝成病毒模擬顆粒，從而擴(kuò)大了它們的向性。研究者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)主要的刺突帶，可能是糖基化的全長(zhǎng)單刺突及其二聚體/三聚體形式。

此外，研究者使用共聚焦分析法對(duì)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞進(jìn)行了確認(rèn)，其表達(dá)了刺突。為了檢查病毒模擬顆粒的先天免疫特性，使用THP-1衍生的巨噬細(xì)胞作為核酸傳感模型，發(fā)現(xiàn)I型干擾素（IFN）和IFN刺激的基因ISG-15和視黃酸誘導(dǎo)的基因沒(méi)有明顯增加I（RIG-I）。由于帶刺突的病毒模擬顆粒比野生型對(duì)應(yīng)物更有效地?fù)饺肓舜掏坏膍RNA和蛋白，因此研究者選擇它作為體內(nèi)評(píng)估的候選疫苗（指定為ShaCoVacc）。

為了獲得ShaCoVacc的免疫原性，研究者將候選疫苗注射到C57BL / 6J小鼠中。在接種疫苗后兩周后，對(duì)小鼠血清進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA），以獲取刺突特異性IgG。研究者觀(guān)察到了刺突特異性IgG的顯著誘導(dǎo)。

為了評(píng)估中和抗體的產(chǎn)生，還使用了編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶的刺突假型HIV進(jìn)行了中和測(cè)定——一種成熟的偽病毒中和測(cè)定。有趣的是，在研究中，單次注射ShaCoVacc可以誘導(dǎo)針對(duì)SARS-CoV-2的即刻有效免疫反應(yīng)，而滅活疫苗則需要至少兩次或三劑注射。

研究者還采用了刺突假型慢病毒，該慢病毒編碼GFP來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh-7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用來(lái)自疫苗接種小鼠的1:40稀釋血清進(jìn)行的預(yù)培養(yǎng)幾乎完全消除了熒光，這對(duì)于安慰劑組和陽(yáng)性對(duì)照很明顯。有趣的是，來(lái)自接種小鼠的血清在Huh-7細(xì)胞中沒(méi)有抑制VSV-G假型慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這表明中和抗體具有刺突特異性。

T細(xì)胞免疫應(yīng)答通常對(duì)于疫苗控制病毒感染的功能很重要。但是，在COVID-19中，細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，對(duì)于任何SARS5 CoV-2疫苗，細(xì)胞免疫都必須謹(jǐn)慎。

在這項(xiàng)研究中，通過(guò)模擬帶有刺突衍生肽池的脾細(xì)胞來(lái)評(píng)估T細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-2的表達(dá)增加，這表明對(duì)于ShaCoVacc而言，刺突特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)并不顯著。這與最近的滅活SARS-CoV-2疫苗研究相一致，該疫苗具有保護(hù)作用，但未發(fā)現(xiàn)接種獼猴的淋巴細(xì)胞和關(guān)鍵細(xì)胞因子的百分比有顯著變化。此外，在疫苗接種過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)ShaCoVacc引起的體重減輕，表明無(wú)明顯毒性。

通過(guò)解剖接種疫苗的小鼠，可進(jìn)一步了解刺突特異性抗體的線(xiàn)性表位特征，研究者使用了一種新開(kāi)發(fā)的肽微陣列，其中包含覆蓋刺突整個(gè)長(zhǎng)度的短肽。研究者發(fā)現(xiàn)，與疫苗接種組的某些刺突肽相對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度各不相同，安慰劑治療的小鼠則未觀(guān)察到信號(hào)。

研究團(tuán)隊(duì)還量化了分別針對(duì)S1域和受體結(jié)合域（RBD）的抗體的信號(hào)強(qiáng)度。接種小鼠的血清在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均引發(fā)了明顯較高的信號(hào)，這與此前刺突特異性抗體的ELISA分析和中和測(cè)定相吻合。

為了獲得表位的全景圖，他們繪制了所有疫苗接種小鼠的熱圖，發(fā)現(xiàn)每只疫苗接種小鼠的抗原決定簇特征是不同的。但是，該研究還發(fā)現(xiàn)了66.7％的接種小鼠有三個(gè)常見(jiàn)的表位（S2-22，S2-76和S2-83）。從康復(fù)者血清中提取的針對(duì)該表位的抗體已顯示出強(qiáng)大的中和活性。值得注意的是，S2-76和S2-83表位是保守的表位，并由SARS-CoV和SARS-CoV-2共享。

總的來(lái)說(shuō)，該研究通過(guò)模擬冠狀病毒表面蛋白和內(nèi)部核酸，從而結(jié)合了滅活疫苗和mRNA疫苗的功能，提供了一個(gè)新的疫苗平臺(tái)。由于SARS-CoV-2的資源有限，研究者目前無(wú)法用真實(shí)病毒再次感染接種過(guò)的動(dòng)物。未來(lái)，研究者將進(jìn)一步揭示了接種小鼠的表位概況和易受特定中和抗體影響的表位，這可能有助于藥物和抗體的開(kāi)發(fā)。